La coloración de Papanicolaou es la técnica por excelencia de la citología general como la hematoxilina eosina lo es para el método histológico. Les presento aquí la técnica original completa y las variaciones prácticas y cotidianas así como otras recetas prácticas que espero les resulten útiles
Para lograr una buena preparación citológica es necesario que el la toma o recolección del material sea adecuada, una correcta y rápida fijación, y un buen proceso de coloración.
Para la Coloración de Papanicolaou es necesario que los preparados sean previamente fijados en alcohol 96º. El material extendido en el portaobjeto debe fijarse inmediatamente antes que comience la desecación. Lo ideal es sumergirlo en alcohol 96º no menos de 10 minutos.
Aerosoles:
Hay fijadores para uso en laboratorio y se utilizan también los fijadores para el cabello en aerosol (spray). Si se utilizan estos últimos es aconsejable optar entre las marcas más económicas porque tienen más alcohol y menos laca.
Se rocía el extendido en forma uniforme durante algunos segundos a una distancia no menor a 15 – 20 cm. Los preparados se secan bastante rápidamente pero si se los envuelve en papel antes que se sequen se suele adherir las fibras de celulosa del papel.
Los preparados fijados de esta manera pueden conservarse hasta dos semanas antes de colorear y esto hace posible la remisión a distancia en caso de no contarse con un laboratorio próximo.
¿Cómo recuperar la muestra cuando el material se dejó secar al aire?
El extendido puede re – hidratarse siempre y cuando no haya habido fijación previa.
Rehidratación:
Procedimiento:
Colocar la muestra de 3 a 5 minutos en una solución a/a (por partes iguales) de agua destilada y glicerina.
Ejemplo 50 ml de agua destilada y 50 ml de glicerina. (3 – 5 minutos)
A continuación escurrir y fijar en alcohol 96º o spray fijador.
El agua hidrata y la glicerina devuelve elasticidad a las células.
¡De no contar con estos elementos!…
Sumergir la muestra para la hidratación directamente en agua corriente durante 3 – 5 minutos y fijar con alcohol 96º o spray. Luego colorear como de costumbre.
Coloración de Papanicolaou:
El Método de Tinción según Papanicolaou es de gran nobleza y ha tolerado infinidad de variaciones resultantes en productos de buena calidad, aptos para la observación microscópica minuciosa que requiere la citología.
Es un método de coloración muy refinado, científicamente probado y comprobado que requiere en su fórmula original una gran cantidad de pasos y da un producto de absoluta sutileza de colores y transparencia.
Método Original de Coloración de Papanicolaou:
1. Alcohol etílico 96º 15 Seg.
2. Alcohol etílico 70º 15 Seg.
3. Alcohol etílico 50º 15 Seg.
4. Agua Destilada 15 Seg.
5. Hematoxilina de Harris 6 Min.
6. Agua destilada 10 inmersiones.
7. Sol ácido clorhídrico 0,5% 1 – 2 inmersiones rápidas.
8. Agua destilada 15 Seg.
9. Sol Amoníaco 1,5% en ol 70º La extensión vira al azul.
10. Alcohol etílico 50º 15 Seg.
11. Alcohol etílico 70º 15 Seg.
12. Alcohol etílico 96º 15 Seg.
13. O G 6 (orange) 2 Min.
14. Alcohol etílico 96º 10 inmersiones.
15. Alcohol etílico 96º 10 inmersiones.
16. EA 50 (36) Eosina amarillenta) 3 Min. (Usar EA 65 para orinas y esputos)
17. Alcohol etílico 96º (10 inmersiones)
18. Alcohol etílico 100º (10 inmersiones)
19. Xilol (10 inmersiones)
20. Montaje: Con Bálsamo de Canadá y cubrir con cubreobjetos de vidrio de la medida adecuada para cobertura total de la muestra.
Cubreobjetos:
Los cubreobjetos de las muestras cérvico vaginales, no deben ser menoers a 24 x 50mm. Tamaños menores indican la escasez de la muestra. En el Hospital Nac. Prof. Dr. A. Posadas las muestras ginecológicas se cubren con cubreobjetos de 24 x 60mm
Recomendación:
Es muy importante respetar el tiempo de la Hematoxilina. La sobrecoloración de los núcleos produce hipercromasia y puede ser causa de interpretación errónea de alteraciones nucleares y sobrediagnóstico.
Los tiempos de coloración con OG6 y EA en cambio son menos exigentes porque actúan por saturación y el exceso de tiempo no tiene consecuencias tan dramáticas como la sobretinción con hematoxilina.
Tinción rápida de Papanicolaou (método modificado)
1. Alcohol 96º
2. Agua corriente 10 pasajes.
3. Hematoxilina 40 Seg.
4. Virar en agua corriente hasta que esta quede transparente sin trazas de colorante.
5. Alcohol 96º 10 pasajes.
6. OG6 40 Seg.
7. Alcohol 96º 10 pasajes.
8. EA 40 Seg.
9. Alcohol 96º 10 pasajes.
10. Alcohol 100º 10 pasajes.
11. Alcohol 100º/xilol a/a 10 pasajes.
12. Xilol 10 pasajes.
13. Montar.
Coloración cotidiana de Papanicolaou (método modificado)
1. Alcohol 96º
2. Agua corriente 10 pasajes.
3. Hematoxilina 45 Seg.
4. Virar en agua corriente hasta que esta quede transparente sin trazas de colorante.
5. Alcohol 96º 10 pasajes.
6. OG6 3 Min.
7. Alcohol 96º 10 pasajes.
8. EA 3 Min.
9. Alcohol 96º 10 pasajes.
10. Alcohol 100º 10 pasajes.
11. Alcohol 100º 10 pasajes.
12. Dejar secar al aire
13. Montar.
Otra manera:
1. Alcohol 96º
2. Agua corriente 10 pasajes.
3. Hematoxilina 45 Seg.
4. Alcohol 96º 10 pasajes.
5. OG6 y EA a/a 3 Min.
6. Alcohol 96º 10 pasajes.
7. Alcohol 100º 10 pasajes.
8. Alcohol 100º y xilol 10 pasajes.
9. Xilol
10. Montar
Medio de montaje sintético:
Distirene (plástico) 100gr.
Dibutilftalato 25gr.
Tolueno o xilol 350 ml.
Mezclar y dejar que la solución esté totalmente transparente y homogénea lo que garantiza una dilución total de los solutos.
Conservador de Saccomano:
Polietilenglicol (en escamas) 20 Gr.
Alcohol 50% 1000ml (un litro)
Polietilenglicol en Pasta:
Colocar en baño de María o estufa, medir en probeta 20 ml y completar hasta 1.000 ml con alcohol 50%
Para preparar la dilución al 50% (para un litro de solución) mezclar
500 ml de alcohol 100
500 ml de agua
Hematoxilina de Harris
Es un colorante nuclear; tiñe la membrana nuclear y la cromatina de color azul oscuro a rojizo purpúreo y el nucleolo de color rojo, rosado o naranja.
Con otras soluciones de Hematoxilina se puede obtener resultados similares.
Se obtiene buenos resultados cuando se ajustan bien los tiempos de coloración.
La ventaja de la Hematoxilina de Harris es que resulta fácil de preparar y envejece (madura) con rapidez por lo cual se puede utilizar en 24 horas.
• Hematoxilina 5gr.
• Aluminio de amonio 100gr.
• Agua destilada 1.000ml
• Óxido de mercurio 2,5gr
Disolver la hematoxilina en el alcohol.
Disolver el aluminio de amonio en agua destilada. Calentar la solución hasta la ebullición.
Añadir la Solución de hematoxilina mezclando con varilla de vidrio y calentar otra vez hasta llegar a ebullición.
Retirar del calor y añadir el Óxido de mercurio; remover ligereamente.
La solución vira al color rojizo púrpura oscuro.
Sumergir el matraz o recipiente en un baño de agua fría para bajar la temperatura rápidamente.
Una vez enfirada filtrar la solución en un frasco oscuro y se deja en reposo no menos de 24 horas para que envejezca (es decir para que madure).
ORANGE G (OG6)
El orange G y la solución EA (eosina amarillenta) se utilizan para teñir los citoplasmas. Ambas son soluciones alcohólicas y el alcohol hace más transparentes a los citoplasmas. Tiñen por saturación.
Solución madre
Es una solución alcohólica al 95% para el colorante Orange G.
El Orange G se presenta en polvo y no se diluye inicialmente en alcohol. Se prepara primero una solución acuosa y luego se diluye.
Se prepara una solución al 10% de Orange G en agua destilada y se remueve hasta que se disuelva el polvo. Conservar en lugar frío y oscuro.
Solución acuosa o madre 50ml
Alcohol etílico 96º 950ml
Ácido fosfotungstíco 0,15gr
Conservar tapado en lugar fresco y oscuro.
Solución alcohólica EA (Eosina verde claro y marrón de Bismarck)
EA 36 Solución acuosa
Verde claro S T 2% amarillento
Marrón Bismarck y al 10%
Almacenar en lugar frío y oscuro 24 a 48 horas.
Para preparar Solución EA 36
Solución reserva Verde claro S T al 0,1% 450ml
Solución reserva marrón Bismarck al 0,5% 100ml
Solución de Eosina al 0,5% 450ml
Ácido fosfotúngstico 2gr
Solución saturada de carbonato de litio 10 gotas
Mezclar bien tapar y almacenarlo en frasco oscuro.
Filtrar antes de utilizar.
Conservación de líquidos
Lo ideal es procesar los líquidos sin conservantes, tal cual se reciben en fresco. De no ser posible es necesario evitar la histolisis.
• Para 10 o 15 ml de muestra utilizar 2 ml de Conservador de Saccomano.
• Duraciónde la fijación: 15 días.
• Heladera (el frío es un método físico de conservación. La heladera común tiene una temperatura de 4º C): 24 a 48 horas. La eficacia de éste método es menor.
La coloración de Papanicolaou permite aplicar otras técnicas sobre la misma sin necesidad de decolorar, por ejemplo:
• Inmunocitoquímica
• Ziehl Neelsen
Cuando es necesario quitar el color se puede utilizar la siguiente técnica:
* Permanganato de Sodio 1gr en 500 ml de agua destilada
* Ácido Oxálico 2 a 5 gr en 100 ml de agua destilada
Colocar los preparados en la solución de Permanganato de Sodio 10 minutos, lavar con agua y luego colocarlos en la solución de ácido oxálico 3 minutos. Lavar con agua y comenzar la fijación y nueva coloración.
Comentario Final:
La técnica de Papanicolaou es muy noble, ha tolerado infinidad de modificaciones y es muy útil para ser aplicada no sólo en citología ginecológica sino también en todo el resto. Por esta razón es la coloración fundamental de la citología general.
Se colorea con ella material obtenido de aparato digestivo (esófago, hígado, páncreas, vías biliares) aparato respiratorio (esputos, lavados bronquiales y bronquioloalveolares, punciones transcarinales y de pulmón), punciones de diversos órganos (tiroides, glándulas salivales, mama, abdominales, tejido linfático), líquidos de cavidades (asscítico, pleural, pericárdico y otros) líquido céfalo raquídeo.
Se ve con claridad: detalles en la flora de los extendidos cérvico vaginales, detalles que expresan la maduración en el epitelio pavimentoso (evaluación hormonal), alteraciones morfológicas nucleares (lesiones pre neoplásicas y neoplásicas), sustancias químicas (glucógeno, moco, asbestos), otros elementos infecciosos (Pneumocistis Jiroveci, parásitos, hongos).
En fin, la coloración de Papanicolaou es la que nos ha acompañado a lo largo de tantos años aliada fundamental de cualquier persona vinculada a la citología.
